生物磁珠體外應用簡述

添加時間:2021年7月19日

生物磁珠體外應用簡述

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2020年全球體外診斷(IVD)市場規模747億美元,上游核心原料約占整體市場的10%,其中生物微球等載體系統約占核心原料的25%,2020年全球IVD生物微球市場空間約為18.675億美元,國內約為17.825億元。其中免疫診斷市場中的國產化學發光試劑廠家對生物磁珠原料的需求最大,主要是進口為主,少量是自產或者國產。小而美的生物磁珠深刻影響IVD市場尤其免疫診斷市場的走向和發展規模。

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生物磁珠體外應用簡述

磁珠可以與藥物、蛋白質、酶、抗體或核酸結合,最開始的磁珠被廣泛應用于多種體內實驗,比如藥物傳遞、磁共振成像(MRI)造影劑和熱療等。但是因為磁珠材料本身的生物相容性和細胞毒性等等因素,限制了磁珠在體內實驗的應用,反而體外實驗應用得到更廣泛的發展,本文主要綜述磁珠在體外實驗的用途,尤其應用在臨床市場上的各種體外診斷技術,以及學術科研領域生物分子的純化應用,比如細胞和外泌體分離、核酸提取、生物藥物的靶點鑒定及代謝性質研究、蛋白純化與免疫層析等等。

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早在上個世紀70年代初就有科學家嘗試使用生物微球來分離細胞,1969年科學家Wigzell和Andersson[1]就開始利用細胞表面抗原和特異性抗體的結合性質原理,使用生物微球分離細胞,所用生物微球沒有磁性,分離速度慢,效率很低,且成本高昂。1976年科學家Guesdon和Avrameas[2]研究磁性的生物微球和抗原/抗體的連接反應,并在1977年成功開發磁性固相酶免疫分析技術,為將來使用磁珠來分離細胞以及更廣闊的分子生物學研究應用打下基礎。所用磁珠為法國Magnogel beads(MG beads),結構為4%的聚丙烯酰胺,4%的瓊脂糖和7%包裹在磁珠里面的氧化鐵,磁珠表面醋酸基團,粒徑范圍為50-160um,屬于羧基磁珠。

1. 細胞分離

1978年科學家AntoineJC等[3]首先嘗試使用磁性固相酶免疫分析技術來分離小鼠和大鼠淋巴細胞,并獲得成功,分離速度快,總回收率在80%-100%之間,所用磁珠同樣為法國的MG beads

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1982年科學家Meier和Lagenaur[4]使用MG beads來分離少突膠質細胞,改善了分離實驗方案,提高分離效率,分離后少突膠質細胞的純度為91.4%,不僅分離速度快,且成本大大降了下來。

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1976-1986年間,科學家JohnUgelstad等[5]發明并改進了Dynabeads,一種彌散結構且具有超順磁性的聚苯乙烯材質的生物磁珠。科學家不僅可以精準控制磁珠的粒徑大小,開發1-100um之間粒徑大小的磁珠,而且磁珠表面官能團種類也豐富很多,廣泛用于選擇性細胞和生物分子的免疫磁分離,包括蛋白純化、細菌分離和核酸提取等
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生物磁珠技術發展至今,不僅磁珠本身的制造工藝,而且磁珠分離細胞的技術均已經非常成熟,目前大部分磁珠廠家均有能應用于細胞分離的產品,技術成熟且比較知名的廠家有德國Miltenyi,美國Dynabeads,德國MagSERIONbeads,法國Ademtech等,大部分廠家均可以提供已經包被對應細胞表面抗原的抗體磁珠試劑盒,使用過程簡單方便,而且主要是3.0um粒徑或者更大的磁珠,比如美國Dynabeads主打4.5um。

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2.核酸提取

除了細胞分離,核酸提取也可以通過無磁的生物微球來進行實驗,包括瓊脂糖和硅膠等,但是效率同樣不高,通過磁珠來提取核酸的最佳方法是在磁珠表面接入鏈霉親和素,再和生物素化配體結合,通過配體捕捉DNA/RNA。1989年科學家Hultman[6]首先使用嫁接了鏈霉親和素的Dynabeads來提取核酸并測序,所用磁珠為粒徑2.8um的Dynabeads。除了鏈霉親和素-生物素原理,使用Protein A/G磁珠捕捉抗體-蛋白質-DNA/RNA,也是常用的方法之一。主要的廠家有美國Dynabeads,美國GE,和美國BioVision等。

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現在臨床檢測市場上普遍使用硅基材質的羥基/羧基磁珠來進行核酸提取,方法是磁珠在某種酸堿條件下和溶液中的核酸通過疏水作用、氫鍵作用和靜電作用等發生特異性結合,迅速從生物樣品中分離核酸,有利于核酸的自動化和高通量提取。這種針對臨床檢測市場的核酸提取磁珠技術比較成熟,已經基本實現國產化,操作簡單方便。

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3. 生物醫藥的靶點鑒定及代謝性質研究。

1990s年代日本科學家Hiroshi Handa等[7]開發FG beads,一種200nm粒徑的聚苯乙烯材質的生物磁珠,可以在有機溶劑中和各種小分子或者生物大分子配體進行連接,研究這些配體的結合性質和代謝功能,主要應用于生物醫藥的靶點蛋白鑒定篩選和作用機理研究。

2006年科學家Hitoshi Uga等[8]用FG beads成功尋找抗癌藥MTX的作用靶點并發現其抗癌機理。2010年科學家Takumi Ito[9]用FG beads尋找鎮靜劑藥物Thalidomide的作用靶點蛋白并弄清楚其作用機理。

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2014年日本科研團隊[10]使用FG beads開發臨床監測抗體藥物代謝功能的新技術,結合了微流控芯片技術,要求使用200nm粒徑的磁珠,粒徑要絕對均一性,稱為nSMOL技術,并與日本島津公司聯合推出上市,用于臨床監測抗體藥物的代謝水平,在生物醫藥合同研究組織(CRO)行業得到廣泛應用。
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4. 蛋白純化與免疫層析
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這是生物磁珠需求量最高的應用項目,所根據的原理起源于科學家Guesdon和Avrameas在1977年開發的磁性固相酶免疫分析技術,主要用來開發臨床體外診斷(IVD)檢測技術,通過用磁珠連接特異性抗體來尋找其作用蛋白/抗原并分離純化,最終檢測蛋白/抗原數量主要的使用技術包括磁微粒化學發光免疫分析技術(CLIA)、微流控磁敏免疫分析技術(MIA)、熒光免疫分析技術(FIA)、單分子免疫檢測技術等。

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(1) 磁微粒化學發光免疫分析技術(CLIA)

CLIA憑借其靈敏度高、特異性好、自動化程度高等優勢,直接檢測對象是發光材料的發光性質,最終計算蛋白/抗原數量,在臨床應用中迅速推廣,已經成為免疫診斷的主導技術,市場占有率超過70%,國內外IVD廠家眾多。隨著中國社會老齡化的增長,免疫診斷市場不斷增長,2019年中國免疫診斷市場規模為278億元。歐美發達國家免疫診斷中化學發光市場占比超90%,我國目前只有80%左右,且國產化學發光試劑占比不到20%,未來五年發展潛力巨大,有望突破50%。

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CLIA對磁珠的性能基本要求和學術應用的要求不同,基本要求如下:磁響應速度快,含磁量高;分散性好、沉降速度慢;化學穩定性高,非特異性吸附低,信噪比高;基團含量高,鍵合力強,靈敏度高。目前大部分磁珠廠家均有能應用于CLIA的產品,技術成熟且比較知名的磁珠廠家有德國Merck beads,日本JSRbeads,美國Dynabeads以及德國MagSERION beads等,國內CLIA市場主要是進口磁珠為主,1-3um粒徑的羧基磁珠最常用,少量氨基磁珠和鏈霉親和素磁珠。
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(2) 微流控磁敏免疫分析技術(MIA)

MIA不同于CLIA,MIA首先需要結合微流控芯片技術,成本較高,采用磁敏傳感器技術,用磁珠捕捉待測蛋白抗體并固定在芯片上,直接檢測對象是帶磁性的磁珠本體數量,具有更高的精度以及更快的檢測速度。MIA是對磁信號的檢測,可以消除生物樣品的干擾,具有超高的靈敏度,并可同時檢測多種疾病分子的能力。MIA主要使用200nm的鏈霉親和素磁珠,對磁珠的粒徑均一性和穩定性有高要求。這項技術在國內比較新穎,但微流控芯片成本較高,國內已有廠家在開發推廣,能否全面走向臨床應用有待觀察。

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(3) 熒光免疫分析技術

POCT是即時檢測(Point-of-care testing),是IVD市場增長最快的領域,常用熒光免疫分析技術(FIA)來檢測抗原/抗體,所用抗體載體多為無磁的納米級別生物微球,或者膠體金,檢測速度極快,且是傻瓜式操作,幾個小時甚至十幾分鐘即可獲得結果,技術成本比CLIA更低。但是FIA易受熒光材料本身的發光性質所影響,常用異硫氰酸熒光素(FITC),Ex-Em是490nm-530nm,靈敏度不高。為了提高檢測靈敏度,目前主要用時間分辨熒光免疫技術(TRFIA),使用鑭系元素銪螯合物(Eu)作為熒光材料,Ex-Em是340nm-616nm,極大地提高了分析靈敏度,是現有的免疫檢測方法中靈敏度最高的、穩定性最好的免疫檢測技術。市場上提供這種熒光微球的主要廠家是美國Bangsbeads、美國Invitrogen beads日本TAMAGAWA的FS beads,以200nm粒徑為主。

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如果使用包含TRFIA熒光材料的磁珠作為抗體載體,結合TRFIA的檢測靈敏度優勢以及CLIA的自動化快速分離優勢,CLIA就能通用于POCT市場。目前POCT市場上提供這種熒光磁珠的廠家主要有美國Spherotech beads,日本TAMAGAWA的FF beads。這種新型熒光免疫分析技術目前最大的問題是熒光磁珠本身,因為磁性和熒光材料會有相互干擾,導致磁性不足或者熒光強度不高,如何解決這兩者的相容性問題是它走向臨床IVD市場的最大條件。

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(4)?單分子免疫檢測技術

單分子免疫檢測技術,顧名思義是通過對單個抗原分子的直接計數實現定量檢測分析打破業內對免疫檢測靈敏度下限的認知,其靈敏度可達fg級別,一般的標記免疫技術(CLIA、熒光免疫等)最高的檢測靈敏度一般在pg級別單分子免疫檢測技術主要用于美國Quanterix的SiMoA系統和德國默克的SMCxPro系統,結合微流控芯片技術,要求使用2.5-3.0um粒徑的磁珠,粒徑要絕對均一性,是對磁珠性能和條件最為苛刻的一種前沿技術,目前生產此粒徑磁珠的主要廠家包括美國Dynabeads和德國MagSERIONbeads等。現在國內已經開始有IVD廠家開發單分子免疫檢測技術,受限于微流控芯片技術成本高昂的條件限制,能否用于IVD市場有待觀察。

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5. 其他體外應用簡述。

根據磁性固相酶免疫分析技術,只要在磁珠上接上特異性抗體,對于分離其他生物大分子或者特殊用途均可以使用磁珠來進行。比如純化外泌體、分離細菌或者病毒,目前市面上廠家均有針對外泌體純化用的磁珠產品,原理一致,具體方案根據外泌體性質會有很大不同,主要廠家包括美國Dynabeads和日本FG beads。

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使用熒光磁珠還可以用于免疫染色,比傳統方法速度更快。

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以上分析了磁珠用于體外實驗的主要應用領域,簡述每種領域對磁珠的使用條件。臨床IVD市場上的磁珠廠家眾多,以進口為主,性能和價格參差不齊,市面上主流使用1-3um的羧基磁珠用來生產CLIA試劑,其他各種粒徑的磁珠均可以用于不同的檢測技術,要根據所用檢測技術的條件篩選合適的磁珠產品。在學術科研領域,物小而精的生物磁珠,尤其在分子生物學方面的應用更加廣闊,開闊了人類對生命科學的認識。

注:關于文章的任何疑問,請咨詢作者郵箱:hillson.zhu@www.futur0.com

 

參考文獻:

[1] Wigzell H. &Andersson B. ( 1969) J. KY,). Med. 129,23.

[2] Guesdon J. L. &Avrameas S. (1976) J. immtmo/. Meth. 11, 12Y.

[3] Antoinc JC, Ternynck T, Rodrigot M, Avramcas S (1978):Lymphoid cell fractionation on magnetic polyacrylamide-agarose beads. Biochemistry,15:443-452.

[4]Meier DH, Lagenaur C, Schachner M (1982): Immunoselectionof cerebellar cells by magnetic beads. I. Determination of antibody couplingparameters and cell binding conditions. J Neurosci Res, 7: 119-135.

[5]JUgelstad, P Stenstad, L Kilaas. BloodPurif, 1993, 11, 349-369.

[6] Hultman T, Stahl S, Hornes E, et al. Direct solid phase sequencing of genomic and plasmid DNA usingmagnetic beads as solid support. Nucleic Acids Res, 1989, 17, 4937-4946.

[7] SATOSHI SAKAMOTO, YASUAKIKABE, HIROSHI HANDA. The Chemical Record, Vol. 9, 66–85 (2009).

[8] H. Uga, et al.A new mechanism of methotrexate action revealed by target screening withaffinity beads.Mol. Pharmacol, 70, 1832 (2006)

[9] T. Ito, et al.Identification of a Primary Target of Thalidomide Teratogenicity.Science, 327, 1345 (2010).

[10] N.Iwamoto, et al, Selective detection ofcomplementarity-determining regions of monoclonal antibody by limiting proteaseaccess to the substrate: nano-surface and molecular-orientation limitedproteolysis, Analyst, 139 (3) (2014) 576–580.

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編輯:Steven | 校對:Harris | 責編:Hillson

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