肺炎支原體丨可為和有為,呼吸道癥候群病原體檢測系列抗原詳解Ⅲ

添加時間:2021年7月21日

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肺炎支原體丨可為和有為,呼吸道癥候群病原體檢測系列抗原詳解Ⅲ

(一)?肺炎支原體的簡述

肺炎支原體(Mycoplasma pneumonia,Mp)是一種常見的病原微生物,主要引起人類呼吸道感染,尤其以兒童和青年為主。Mp是兒童社區獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)的重要病原體),可占CAP的10%-30%。

據WHO公布的數據顯示,全球每年約有1.56億例兒童臨床性肺炎新發作,其中95%以上發生在發展中國家。在2015年世界上就有920136名5歲以下兒童死于肺炎。其中由肺炎支原體引起的感染數量排第二,僅次于肺炎鏈球菌。針對Mp感染及其肺炎等引起誤診、漏診及過度診斷在臨床上亟待解決。

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(二)?兒童Mp感染誤診、漏診及過度診斷的原因

1. 臨床表現不典型、缺乏特異性,不同年齡階段的臨床表現各不相同,尤其在嬰幼兒。

2. 以肺外表現為首發者往往被漏診,混合感染患兒Mp作為病原也易被忽視。

3. 部分MPP患兒呼吸系統癥狀輕,甚至無呼吸道癥狀,影像學異常改變滯后,從而未做MP病原學檢查而導致漏診。尚需注意有些確診為MPP的患兒胸部CT發現的異常在胸X線片上未能顯示出來。

4. 大環內酯類抗菌藥物耐藥的Mp感染者,經驗性給予大環內酯類療效不佳,屆時如果輕易除外Mp感染就有可能導致漏診。

5. 實驗室診斷誤差致臨床誤診、漏診和過診:

1)?血清學檢測IgM抗體誤差,Mp抗體檢測應該定量而非定性,單純定性容易過多診斷Mp感染。此外,一項調查急性Q熱肺炎流行率的研究表明,Q熱肺炎者可由于交叉反應引起Mp-IgM陽性,容易被誤診為MPP。

2) PCR檢測誤差,雖然核酸擴增技術有特異性強、靈敏和快速的優點,但也不可忽略樣品中存在PCR抑制物、試劑制備和反應條件不理想、靶DNA提取效率低下等造成假陰性的情況。感染Mp后可不出現癥狀但持續攜帶,這會造成假陽性的結果。核酸擴增DNA檢測并不能區分攜帶者與感染者、急性感染者與恢復期患者,單純依賴PCR檢測有可能導致MP感染的過度診斷。

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(三)?國際上Mp感染診斷策略

1.

?國內Mp的診斷策略

隨著Mp感染重癥和難治病例的不斷增多,早期、快速、準確診斷是臨床對實驗室診斷方法學提出的迫切需求,而實驗室結果的合理解讀也是臨床恰當診治的重要前提;目前,Mp的檢測方法主要分為病原學檢測和血清學檢測兩大類,根據《中國兒童肺炎支原體感染實驗室診斷規范和臨床實踐專家共識(2019年)》提出建議,Mp感染的實驗室診斷,抗體檢測優先于抗原檢測,如能獲取急性期與恢復期雙份血清,抗體檢測的價值更大。

《兒童肺炎支原體呼吸道感染實驗室診斷中國專家共識》的感染實驗室診斷流程圖如下:

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圖1 ?Mp呼吸道感染實驗室診斷流程圖

在臺灣長庚醫院的兒童肺炎支原體肺炎的合理分階段治療流程圖中,其Mp感染的實驗室診斷策略為:

1)?血清轉化(IgM由陰性轉化為陽性);

2)?間隔兩周內,抗體滴度增加(IgM增加2倍或IgG增加4倍);

3) PCR 陽性。

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圖2:兒童肺炎支原體肺炎的合理分階段治療

2.

國外Mp的診斷策略

在瑞士蘇黎世兒童醫院的研究中,在的檢測過程中,Mp-IgM和PCR聯檢可使其陽性檢測率高達99%。

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圖3:兒童肺炎支原體肺炎的聯合檢測

終上所述,國際上Mp感染的血清學以血清學聯合病原學檢測為診斷策略。

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(四)?Mp抗體免疫應答的抗原選擇策略

1.

Mp的血清抗體

人體感染Mp后能產生IgM、IgA、IgG類抗體:

IgM:感染一周內升高,2-3周達到高峰,4周后開始下降,2-3月降至最低,可作為近期感染的診斷指標;

IgA:感染早期迅速上升,7-14天至峰值水平,變化與IgM一致,但回落更早;

IgG:感染后14天左右出現,在第5周達到高峰,可長期維持,提示既往感染。

2.

Mp的血清抗體的免疫應答反應

在法國的圣艾蒂安大學的微生物實驗室的研究中,Mp可引起多種免疫應答,通過試驗來確定在MP患者的血清中產生免疫應答的主要蛋白,從結果中可以看出,患者血清中可識別的MP蛋白可多達30多種,其中主要以180kDa、172KDa、120kDa、115kDa、92kDa、84kDa、66kDa、55kDa、43kDa等。

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圖4:肺炎支原體的免疫應答反應

1)?Mp-IgM產生的免疫應答

Mp患者的血清中,在感染過程中的第二周直至第三周,IgM所識別的蛋白主要有168kDa、155kDa、145kDa、84kDa、56kDa等多個蛋白位點,直到第4-5周其所引起的條帶略微下調。

2)?Mp-IgG產生的免疫應答

Mp患者的血清中,在感染過程所識別的蛋白變化很大,但從感染至整個過程中持續引起IgG免疫應答的主要蛋白為168kDa。

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圖5:Mp-IgM和Mp-IgG免疫應答過程中所識別的蛋白

3.

Mp的血清抗體的抗原策略

用于抗體檢測試劑的Mp抗原選擇非常重要,他決定了檢測的敏感度和特異度,根據上述所列的抗體及抗體參與的免疫應答情況可知,目前主要的抗原為全菌體抗原和P1黏附蛋白。

1)?關于全菌體抗原

Mp全菌體裂解物(全菌體抗原):

包括細胞膜的糖脂、蛋白質等成分;涵蓋抗原位點齊全,可用于Mp-IgM、Mp-IgG抗體檢測。

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圖6:肺炎支原體蛋白的結構示意圖

2)?關于Mp-P1蛋白

Mp-P1蛋白能刺激機體產生較強烈的免疫應答,是Mp診斷的重要抗原;其中P1基因包含4881個核苷酸,可編碼1627個氨基酸,其中包含了21個UGA密碼子,在編碼的過程中,UGA是終止密碼子。因此重組蛋白無法獲取P1蛋白的全長片段,通常以N端(P1-N1)和C端(P1-C1)區域為黏附蛋白的免疫區。

N端(P1-N1)分子量:13.9kDa;

C端(P1-C1)分子量:~39.7kDa;

在免疫印跡過程中發現,兩者均能與單抗反應,患者血清只識別重組純化C端(P1-C1)。

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圖7:P1的基因組和P1不同片段反應

在重組表達的過程中,不同的提取方法獲取的蛋白濃度不同;如下圖:

1:大腸桿菌的空載體

2:大腸桿菌誘導表達重組P1的裂解物;

3:超聲和離心后細胞裂解物的沉淀部分;

4:超聲和離心后細胞裂解物的上清液;

5:色譜提純;

6:凝膠過濾和色譜法提純。

由此可知,其蛋白的純度與提純方式有關,色譜法可獲取較高純度的P1重組蛋白。

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圖8:不同提純方法的P1蛋白純度情況

在同等的濃度168kDa的蛋白含量的反應過程中發現,Mp-IgG與P1蛋白的吸光值高于Mp-IgM,由此可知,P1蛋白與Mp-IgG的免疫應答反應性更高,更適用于于Mp-IgG檢測。

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圖9:P1蛋白與Mp-IgG和Mp-IgM的反應

在荷蘭萊頓大學醫學中心的研究中,比較了12種檢測Mp-IgM和Mp-IgG抗體的檢測試劑,結果表明,使用全菌體抗原的SerodiaMycoII、ImmunoWell和CFT的診斷性能比較高,使用富含P 1抗原的診斷Mp-IgM的性能不如含全菌體抗原,其中使用SERION全菌體抗原的CFT試劑檢測Mp-IgM的準確度最高,其中ROC曲線也為最高。

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圖10:不同抗原在Mp-IgG、Mp-IgM中的應用對比

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(五)?總結

綜上所述,Mp是CAP的常見病原體,早期、快速、準確診斷是解決Mp感染的臨床學若干問題的關鍵,合理的應用診斷策略和選擇合適的抗原策略是提高Mp感染實驗室診斷的必要條件,也是結合臨床恰當診治的重要前提。

作者:維潤賽潤 原料事業部

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注:關于文章的任何疑問,請咨詢作者郵箱:hillson.zhu@www.futur0.com

參考文獻:

【1】?Pathogenesis of Mycoplasma pneumoniae: An update【2】?Diagnosis of Mycoplasma pneumoniae Pneumonia with Measurement of Specific Antibody-Secreting Cells

【3】?Rational stepwise approach for Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children

【4】?lmmunoblotting patterns with Mycoplasma pneumoniae of serum specimens from infected and non-infected subjects

【5】?Expression and Immunological Characterization of the Carboxy-Terminal Region of the P1 Adhesin Protein of?Mycoplasma pneumoniae

【6】?Reaction Pattern of Human Anti-Mycoplasma pneumoniae Antibodies in Enzyme-Linked Immunosorbent Assays and Immunoblotting

【7】?Production and characterization of recombinant P1 adhesin essential for adhesion, gliding, and antigenic variation in the human pathogenic bacterium,?Mycoplasma pneumoniae

【8】?Evaluation of 12 Commercial Tests and the CoMplement Fixation Test for?Mycoplasma pneumoniae-Specific Immunoglobulin G (IgG) and IgM Antibodies, with PCR Used as the “Gold Standard”

【9】?中國兒童肺炎支原體感染實驗室診斷規范和臨床實踐專家共識(2019年)

【10】?兒童肺炎支原體呼吸道感染實驗室診斷中國專家共識

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編輯:Steven | 校對:Harris | 責編:Hillson

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